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天津市安定医院精神科 强迫游泳

创伤性应激障碍样大鼠海马 GABA

创伤后应激障碍 ( post-traumatic  stress  disor- derPTSD) 是一种复杂的焦虑障碍患者在经历了严重的创伤性事件后表现出回避性行为恐惧增强及后觉醒状态1PTSD 的病因复杂其机制的探索首先需要建立一个良好的动物模型模拟PTSD 的特征即: ①具有短期强烈的应激事件;模拟 PTSD 患者的核心症状即对创伤性线索的反应性增强过度觉醒以及社会回避表现; ③症状可持续存在甚至随着时间而增强2单次延长刺激模型 ( single-prolonged stressSPS) 能够较好模 PTSD 发病过程及患者出现的部分核心症状逐渐产生的焦虑行为和过度觉醒因此日渐受到研究者的关注并广泛用于 PTSD 的神经生物学机制研究3SPS 造模4是一个连续的过程这种连续性应激可使动物对条件恐惧僵住反应增强同时损坏其恐惧记忆的消退功能*终导致动物对创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应4γ-氨基丁酸 ( γ-aminobutyric acidGABA) 是**神经系统重要的抑制性神经递质可以调节机体面对应激时的生理反应5GABA 受体包括离子型的 GABAA  G-蛋白偶联的 GABAB 受体两种亚型均在焦虑调节中发挥重要作用6分子遗传学研究发现 GABA 系统和 PTSD 的发生具有关联性例如GABA β3 亚基 3 端的微卫星序列的多态性和 PTSD 的发生率存在相关性7另有研究发现 PTSD 患者的脑内 GABA 水平降低8因此GABA 系统的功能异常可能参与 PTSD 的发生马是负责空间学习记忆的重要脑区主要功能是将短期记忆固化为长期记忆以及空间记忆的形成同时大量研究表明海马也参与应激及情绪的调节3影像学研究发现 PTSD 患者的海马同遭受应激但是没有 PTSD 症状的人相比显著缩小9示海马的功能异常可能参与 PTSD 的发生CA1 和CA3 是海马的重要亚区CA3-CA1 突触传递在学习记忆和应激反应中发挥重要作用但研究发现CA3  CA1 对应激的反应如应激导致的长时程增强 ( long-term  potentiationLTP) 及一些基因的表达调节是不同的这取决于应激的种类和应激时间10-11因此在本研究中我们将应用 SPS  作为 PTSD 的动物模型验证 SPS 所导致的增强的焦虑性行为并观察其对海马 CA1 CA3 亚区 GABAA GABAB 受体的蛋白表达量的影响

1 对象与方法

1. 1 实验动物

雄性 Sprague-Daw ley  ( SD ) 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司许可证号: S ( 京) 2001  2003体重平均在 200  220g采用12 小时昼夜节律控制 (8: 00  20: 00 )。实验室湿度和温度均符合实验标准实验开始前动物在动物房适应性饲养 7 d自由饮水进食实验大鼠随机分为未造模组SPS 造模 1 d 和SPS 造模 14 d 组每组各 8 只经过造模后SPS 造模 1 d 和SPS 造模14 d 所剩动物分别为7 只和6 只应用旷场和高架十字实验测试 3 组大鼠的焦虑程度; 行为学测试 24 h 后断头取脑检测 CA3  CA1 脑区GABAA  GABAB 的表达情况

1. 2 实验材料和试剂

强迫游泳斗牛金花app下载官网; 电泳仪电泳槽北京伯乐生命科学发展有限公司; 大鼠束缚容器北京大学中国**依赖性研究所;  高架十字迷宫中国医科院协和**所兔GABAA 抗体 ( Abcam美国),抗兔GABAB 抗 ( Abcam美国),抗小鼠 β-Actin 抗体 ( 中杉金桥中国),辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG抗体 ( 中杉金桥中国),辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体 ( 中杉金桥中国)。

1. 3 PTSD 模型的建立

成年SD 大鼠在动物房适应性饲养7 d 左右.首先使用硬质塑料盒 ( 使大鼠四肢及躯干束缚在瓶中尾巴露在外面) 给予大鼠 2 h 的束缚紧接着让其在 20  24 ℃ 水温进行 20 min 的强迫游泳 之后休息15 min*后用乙醚麻醉直至无抵抗束缚期间温度和湿度都与正常饲养环境一致待应激结束后分笼放回动物房饲养





开臂区停留时间及 EPM 指数显著降低 ( P 0. 05); 造模 1 d 组差异没有统计学意义 ( P 0. 05) ( 2)。





2. 2 大鼠 SPS 应激后海马 CA1 CA3 脑区的 GA- BA 受体表达水平

Western blot 发现不同处理组间 CA1 脑区GABAA 受体和 GABAB 受体表达差异有统计学意Post-hoc 分析发现同未造模动物相比造模 14 d 组大鼠 CA1 脑区的 GABAA 受体和 GABAB 受体的表达含量显著降低 ( P 0. 05 ); 造模 1 d 组差异没有统计学意义 ( P 0. 05) ( 3)。



    不同处理组间 CA3 脑区 GABAA 受体和 GAB- AB 受体表达差异有统计学意义Post-hoc 分析发现同未造模动物相比造模 14 d 组大鼠 CA3 脑


GABAA 受体和 GABAB 受体的表达含量显著降 ( P 0. 05 ); 造模 1 d 组差异没有统计学意义( P 0. 05) ( 4)。



创伤后应激障碍的临床症状表现多样主要是 患者在经历精神创伤性事件后数天至数月内发生的 创伤性经历再体验情感麻木回避行为和过度觉 醒导致的易激惹状态1建立效度好的动物模型 是研究 PTSD 发病机制的关键手段之一但目前仍无一个被广泛接受的动物模型之前的研究已经构 建了一些动物模型如电击模型捕食者场景模型以 及边缘系统点燃模型等2虽然这些模型在一定 程度上模拟创伤性应激但是对于一些 PTSD 的关键特征如由创伤性应激导致的时间依赖性增强的 敏感化表现并不能很好的模拟4有研究表明

Liberzon 等建立的 SPS 动物模型可较好地模拟PTSD 患者出现的恐惧记忆焦虑反应增强警觉性明显增高及相关神经***改变4同时经历了 SPS 的动物还表现出恐惧记忆消退受损进而导致动物对与创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应因此SPS 动物模型已经成为目前常用的PTSD 动物模型之一3本研究采用SPS 动物模型发现动物经历 SPS 造模后第 1 天的焦虑样行为无显著性变化而在第 14 天的焦虑样行为显著升高验证了 Serova 等多个课题组关于 SPS 可以导致延迟性发生的焦虑反应增强和警觉度增高的现 14表明 SPS 模型具有好的效度和重复性

有研究指出,海马在调控应激和焦虑样行为中发挥着重要作用15。长期束缚应激导致大鼠海马CA3 亚区神经元树突萎缩,动物在高架十字迷宫开放臂中的探索减少16。机体在遭受应激时 CA3- CA1 的 LTP 受损同时伴随有 BDNF 的降低1017。临床研究发现,创伤后应激障碍患者对环境性线索 的识别受损,提示海马功能受损可能在 PTSD 发病中发挥着重要作用。GABA 是神经系统中重要的抑制性递质,可以防止神经系统的过度激活及谷氨 酸的过度释放18。动物实验发现慢性应激可导致 海马 CA1 和 CA3 区 GABA 能神经元数量降低19, 慢性暴露于应激水平的肾上腺皮质**导致海马GABAA 受体亚基表达异常,但是不同亚基表达变化在 CA1 和 CA3 区呈现不同的模式11。临床发现,GABA  β3 3'端的微卫星序列的多态性和 PTSD的发生率存在相关性7。本研究发现 SPS 造模 14 d 后海马 CA1 和 CA3 亚区中的 GABAA 和 GABA蛋白表达均显著性降低,这和其焦虑样行为出现的 时间点相符,这和前人关于机体遭受应激 CA3- CA1 的 GABA 递质传递调控异常的研究相一致, 并进一步提示海马的 GABA 受体异常表达可能调控 PTSD 部分症状发生,如增强的焦虑及警觉度。本研究的不足之处是未对 SPS 导致的其他PTSD 样行为特征如恐惧记忆的形成和消退的影响, 及PTSD 样行为和 GABA 受体的表达降低进行因果关系探索。因此,今后的研究中我们将对 CA1  和CA3 脑区 GABA 受体进行调节, 以便观察海马CA1 和 CA3 脑区 GABA 受体的异常表达是否调控了大鼠 PTSD 样行为的产生。