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睡眠剥夺-对大鼠脾脏**细胞生物钟基因表达水平的影响

睡眠剥夺对大鼠脾脏**细胞生物钟基因表达水平的影响

邢陈1 顾晔1徐秀段1 邹书仙1 胡永亮1 胡美茹1 宋伦1

摘要   目的 探讨 72  h 睡眠剥夺( sleep deprivationSD) 对大鼠脾脏**细胞生物钟基因表达水平的影响 将大鼠随机分为正常对照组和SD 组SD 组大鼠使用SD 仪进行睡眠剥夺72 h 后取脾脏制备成单细胞悬液 利用**细胞分离液获得**细胞; 分别通过 T-PC 和**印迹方法检测大鼠脾**细胞中生物钟基因mNA和蛋白水平的变化结果    与正常对照组相比SD 组大鼠脾脏生物钟基因 bmal1clockper2rev-erbα 的mNA相对表达水平呈现显著下调而 npas2per1rorαcry1 mNA 相对表达水平无显著变化与正常对照组相比72  h  SD 后脾脏**细胞 BMAL1NPAS2CY1Oα 蛋白表达水平显著下调PE1  蛋白表达水平呈升高趋势而 EV- EBα 蛋白表达水平无显著变化结论    72  h  SD 应激条件可在转录和翻译水平诱导大鼠脾多种核心生物钟基因 表达水平发生异常改变

关键词 睡眠剥夺; 昼夜节律; 生物钟; 基因表达; **细胞

昼夜节律产生和维持的遗传基础受控于由一系 列生物钟基因( bmal1clcokcryperrev-erbαrorαdbptefhlf 等) 构成的负反馈环路 3生物钟基因广泛存在于机体各**器官组织和细胞中使得**细胞迁移和趋化吞噬杀伤活性等**功能以及循环**细胞及其亚群的相对和优良数量细胞因子水平等多种**参数呈现显著的昼夜节律性变化从而在维持**稳态中发挥重要作用45

睡眠 觉醒周期是机体重要的一种昼夜节律现象对维持个体生存和正常生理心理功能至关重要与睡眠 觉醒周期节律性转换相适应细胞因子分泌水平循环**细胞数目**细胞功能及活性等多个方面都呈现昼夜节律性变化6 9由睡眠剥夺( sleep deprivationSD) 、睡眠缺失和睡眠相关**等引起的睡眠节律紊乱后机体**功能呈现 显著异常变化10  13由于昼夜节律的遗传基础是由生物钟基因决定的睡眠节律紊乱诱发的**功 能异常应与昼夜节律和生物钟系统具有密切关系脾脏是机体重要的外周**器官本研究拟定通过SD 诱发的睡眠节律紊乱动物模型为研究起点直接研究 SD 对脾脏生物钟基因表达的影响期望阐明睡眠节律紊乱对脾脏内源性昼夜节律和生物钟系统 的影响

1 材料与方法

1 1 材料

TRIzol 试剂( Sigma 公司) ; 逆转录试剂盒BCA 蛋白定量试剂盒( Thermo 公司) ; 琼脂糖粉( Lonza 公司) ; PBS 缓冲液( Gibco 公司) ; IPA 组织裂解液( 碧云天生物公司) ; BMAL1CLOCKNPAS2CY1PE1PE2OαEV-EBα 和 β-ACTIN抗体( Santa Cruz 公司) ; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔羊抗鼠二抗( 鼎国昌盛生物公司) ; ECL 显色液( 天根生物公司) 。

1 2    睡眠剥夺动物模型构建

12  SD 大鼠( 雄性体质量 180  200 g) 按随机数字表法分为正常对照组和 SD 组每组 6 只在军事科学院军事医学研究院实验动物中心饲养 给予12 h 光照/12 h 黑暗交替处理适应环境7 d 后开始实验SD 组大鼠采用 DB036  SD 仪( 北京智鼠多宝生物科技有限公司) 进行 SD 处理 72 h在此过程中每只大鼠都处于独立的空间可自由进食 和饮水

1 3 标本采集

在进行 72 h SD 后 2% wu***钠将大鼠麻醉取脾脏制备成单细胞悬液利用**细胞分离液分离获得脾**细胞分别加入 TRIzol 和IPA裂解液制备成 T-PC 和 Western 印迹实验样品

1. 4    RT-PCR

用TIzol 抽提脾**细胞总NA 并测定浓度 按照逆转录 PC 试剂盒说明逆转录合成 cDNA PC 扩增 bmal1clocknpas2cry1per1per2rev- erbαrorα 基因 1 列出相应生物钟基因引物序列信息

1 5 Western 印迹检测

IPA裂解脾**细胞后4 ℃ 12  000  r / min离心 30  min取上清用 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量各样品取等量蛋白进行 SDS-PAGE  电泳进行转印 5% 脱脂牛奶室温封闭 1  h经过一抗 4 ℃ 孵育过夜二抗室温孵育 2 hECL蛋白显色液试剂显色在暗室红外光下显 BMAL1、CLOCK、NPAS2、CRY1、PER1、PER2  、REV-ERBαORα 蛋白表达水平变化情况


1. 6 统计学分析

利用 SPSS19 0 软件进行数据分析所有数据用 x珋± s 表示组间差异比较采用 t 检验P  0 05 表示差异具有统计学意义

2 结果

2. 1 睡眠剥夺对大鼠脾**细胞中生物钟基因mRNA 表达水平的影响

为了在转录水平分析睡眠剥夺对脾**细胞核心生物钟基因表达的影响通过 T-PC 检测正常对照组和睡眠剥夺组大鼠脾**细胞核心生物钟基  因 bmal1clocknpas2cry1per1per2rev-erbα  rorα mNA 表达水平结果显示与正常对照组相比72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 bmal1clock  rev-rebα mNA 表达水平呈现一定程度降低变化 npas2cry1per1per2  rorα mNA 表达水平无显著改变( 1) 。以上结果表明睡眠剥夺应激条件下脾各生物钟基因的转录活性所受影响存在差异bmal1 clock  rev-erbα 对睡眠剥夺应激因素相对于其他核心生物钟基因更为敏感


22 睡眠剥夺后大鼠脾**细胞生物钟基因mRNA相对表达量的变化

通过灰度扫描对睡眠剥夺后大鼠脾**细胞核 心生物钟基因 bmal1clocknpas2cry1per1per2rev-erbαrorα mNA 表达水平进行相对定量分析以进一步明确睡眠剥夺对脾**细胞生物钟基因mRNA 表达水平的影响结果显示与正常对照组相比72  h  睡眠剥夺后脾**细胞  bmal1clock per2rev-erbα  mRNA 相对表达水平呈显著下调 npas2per1rorαcry1 mRNA 相对表达水平无显著变化( 2) 以上结果进一步表明睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟基因 mRNA 表达水平受到较为显著影响但各生物钟基因对睡眠剥夺应 激因素的敏感性存在差异


23 睡眠剥夺对大鼠脾**细胞中生物钟蛋白表达水平的影响

为了在翻译水平分析睡眠剥夺对脾核心生物钟 基因表达的影响通过**印迹方法检测正常组和 睡眠剥夺组中大鼠脾**细胞核心生物钟基因bmal1clocknpas2cry1per1per2rev-erbα  rorα 的蛋白表达水平结果显示与正常对照组相比72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1NPAS2CRY1Oα 蛋白表达水平显著下调PE1 蛋白表达水平呈升高趋势而 EV-EBα 蛋白表达水平无显著变化( 图 2) 此外CLOCK 和 PE2 蛋白可能因表达丰度较低在正常对照组和睡眠剥夺组未检测到较为 显著的蛋白信号以上结果表明睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟基因蛋白表达水平受到显著影响


24 睡眠剥夺后大鼠脾**细胞生物钟蛋白相对表达量的变化

通过灰度扫描进一步对睡眠剥夺后大鼠脾** 细胞核心生物钟蛋白 BMAL1NPAS2CRY1PER1EV-EBα 和 Oα 的表达水平进行相对定量分析结果显示与正常对照组相比72  h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1NAPS2CRY1  ORα 蛋白表达水平显著下调PE1  蛋白表达水平显著升高而 EV-EBα 的蛋白表达水平无显著改变( 表3) 。以上结果进一步表明睡眠剥夺应激条件下脾多种核心生物钟蛋白表达水平呈较为显著的波动变化



3 讨论

睡眠 觉醒周期与**系统之间存在交互作用大量研究主要集中在睡眠对**功能的下行调 控作用及机制研究及以**应答为起点对睡眠的 上行调控作用及机制研究在睡眠对**功能的调 控作用研究中睡眠剥夺对**系统昼夜节律和生 物钟系统的影响也逐渐受到关注前期研究发现 睡眠剥夺应激条件( 243648 h) 对脾**细胞生物钟振荡幅度的影响相对较小这可能是由于生物钟 基因的内在相互调控作用使得机体内源性生物钟系  统维持稳定但当继续将睡眠剥夺时间继续延长至  72 h 后睡眠剥夺对生物钟基因振荡幅度增加或减弱的影响逐渐显现本研究中72  h 睡眠剥夺应激条件诱发的脾多种核心生物钟基因在转录和翻译水平都可受到显著影响但在总体变化趋势上存在一定差异在转录水平72  h 睡眠剥夺后脾**细胞 bmal1clockper2rev-erbα 的mRNA 相对表达水平呈显著下调而在翻译水平 72 h 睡眠剥夺后脾**细胞中 BMAL1NPAS2CRY1ORα 蛋白表达水平显著下调以上结果表明睡眠剥夺应激条件对生物钟基因表达调控的影响即可能同时体现在转录和翻译水平( BMAL1) ,也可能仅单独体现在转录水平或翻译 水 平 (  CLOCKNPAS2PE2CY1EV-ERBαORα) 。造成以上结果的原因一方面可能是由于生物钟的表达呈现节律性振荡规律而在转录和翻译过程存在时间错位使得生物钟基因的mRNA 和蛋白变化趋势可能在同一时间节点存在错位和差异另一方面除在转录水平生物钟基因在翻译翻译后修饰和降解机制方面也存在周期性振荡变化14 16因此睡眠剥夺诱发的脾**细胞clocknpas2per2cry1rev-erbαrorα mRNA 和蛋白表达水平的差异变化可能也是由于睡眠剥夺应激因素对以上生物钟蛋白的翻译翻译后修饰和降解机制方面产生的影响所引起的

本研究结果表明脾多种核心生物钟基因表达 水平在睡眠剥夺应激条件下呈现显著的异常变化在本研究体系中bmal1clocknpas2per1per2cry1rev-erbα  rorα 都分别在 mRNA 或者蛋白水平受到不同程度的影响以上结果表明脾作为机体 重要的外周**器官其内源性的生物钟系统在睡 眠剥夺应激条件下发生一定程度的异常波动脾**细胞生物钟系统表达调控异常变化也可 视作睡眠剥夺诱发**系统功能异常的重要早期病 理效应之一