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自由落体打击器-丙戊酸对颅脑损伤大鼠海马成体神经干细胞原位激活的作用

丙戊酸对颅脑损伤大鼠海马成体神经干细胞原位激活的作用

杨伟锋1 金保哲2 张新中2 王 磊1 周文科2 王仲伟2

( 1 新乡医学院 2013 级硕士研究生河南 新乡 453003; 

2 新乡医学院**附属医院神经外科河南 卫辉453100)

 

摘要:目的观察丙戊酸( VPA) 对颅脑损伤后大鼠海马成体神经干细胞( NSC) 原位激活的作用方法将成年健康Sprague-Dawley 雄性大鼠 66 只随机分为正常对照组( n = 6) 单纯损伤组( n = 30) 和VPA **组( n = 30) 正常对照组大鼠不做任何处理单纯损伤组及 VPA  **组大鼠建立闭合性颅脑损伤模型;  VPA  **组大鼠按每天300   mg·kg   1      的剂量经腹腔注射给药进行干预单纯损伤组大鼠给予腹腔注射等量的生理盐水进行干预分别于颅脑损伤  37142128    d   断头取脑标本采用**荧光技术检测各组大鼠不同时间点海马齿状回   5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷( Edu) 阳性细胞数及大鼠海马齿状回内巢蛋白( Nestin)   阳性细胞数的变化     单纯损伤组和 VPA **组大鼠海马齿状回内 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数于造模后第 3 天开始增高于造模后第 21 天达高峰 在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组大鼠 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数均高于正常对照组( P  0 01)  VPA **组各时间点 Edu 阳性细胞数及 Nestin 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P  0 01) 结论    丙戊酸对颅脑损伤大鼠海马成体 NSC 有原位激活作用

关键词:创伤性颅脑损伤; 丙戊酸; 大鼠; 神经干细胞

中图分类号:  394 2    文献标志码:  A    文章编号:  1004-7239( 2016) 06-0469-04


丙戊酸( valproic  acidVPA) 是目前临床一线广谱抗癫痫药在预防和控制癫痫发作中发挥着主要 作用VPA 是分子量很小的短链脂肪酸 8 个碳原子和脂肪酸支链组成能很好地透过血脑屏障近年来有研究表明VPA 在**脑卒中阿尔茨海默病帕金森病等神经系统**中有显著疗效1-4作者通过制作重型颅脑损伤大鼠模型造模成功后给予 VPA 进行干预于不同时间点取材测定颅脑损伤大鼠脑组织中 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷( 5-e- thynyl-2'- deoxyuridineEdu) 细胞及巢蛋白( Nestin)阳性细胞的表达及其动态变化观察 VPA 对颅脑损伤大鼠海马成体神经干细胞( neural  stem  cellNSC)的原位激活作用

1 材料与方法

1 1 实验动物    健康清洁级成年 Sprague-Dawley ( SD) 雄性大鼠 66 只体质量 250  300  g由北京维通利华实验动物技术有限公司提供许可证号: SCXK ( ) 2012-0001 : 11400700108852。

1 2主要试剂及仪器 鼠自由落体打击器( 北京智鼠多宝生物科技有限公司) Edu 组织切片试剂  ( 美国 Gene  Copoeia 公司) VPA ( 北京百灵威科技有限公司) Nestin 单克隆抗体( 英国 Abcam 公司) 羊抗鼠荧光二抗4'6-二脒基-2-苯基吲哚( 4'6- diamidino-2-phenylindoleDAPI)  染色反应液(  美 Gene Copoeia 公司) BM-IX 型生物组织包埋机( 孝感市宏业医用仪器有限公司) Shan Don Finesse 325型石蜡切片机( 美国 Thermo 公司) **荧光显微镜( ECLIPSE 55i日本 Nikon) 

1 3动物分组及模型制备 健康清洁级成年 SD雄性大鼠 66 只随机分为正常对照组( n = 6) 单纯损伤组( n = 30) 和 VPA **组( n = 30) 正常对照组大鼠不做任何处理; 单纯损伤组VPA **组大鼠以 Feeney 方法5-6制作颅脑损伤模型将大鼠置于底座固定头部质量分数 10% 水合氯醛麻醉 剪去大鼠顶枕部毛发常规**在顶枕部的中线偏 右约 5 mm 处纵行切约 4 cm 切口钝性剥离软组织和骨膜充分暴露颅骨在人字缝前 3 mm颅骨中线旁 3 mm 处钻一直径约 5 mm 的圆形骨孔可见硬脑膜注意保护其完整完好大鼠自由落体打击 器以 25 g 打击锤从 20 cm 的高处自由落体打击造成大鼠闭合性颅脑损伤成功后骨蜡封闭骨破损区 缝合头皮术后 VPA **组大鼠给予腹腔注入VPA按每天 300  mg·kg  1 的剂量经腹腔注射给药连续给药至处死当天; 单纯损伤组大鼠术后经腹腔给予等量的生理盐水; 术后将大鼠分笼饲养在动物专用饲养室

1 4 造模大鼠行为学评分及入组标准 参照大鼠神经功能评分( neurological  severity  scoresNSS) 7于术后第 147142128 天对各组大鼠神经功能进行评分包括运动感觉反射及平衡能力 4 项 *高 18 分*低 0 分轻度损害: 1  6 分中度损害: 7 12 分重度损害: 13 18 分入组标准为术后第 1 天评分 5 15 分

1 5取材与制片 按分组给予 Edu 标记( 参照说明书) : 采用生理盐水溶解 Edu 至 0 5  g·L  1  50  μg·kg  1 每只大鼠尾静脉注射 20  μL连续注  2 d将单纯损伤组及 VPA **组大鼠分别在造模后第 37142128 d 分别 6 只大鼠质量分数10% 水 合 氯 醛 麻 先 用 肝 素 化 生 理 盐 水10 U·mL  1 快速灌注然后换 40 g·L  1 多聚甲醛灌注至 肢体抽搐断 头取脑冲 xi脑表面积血 40 g·L  1 多聚甲醛固定过夜以视交叉为中心向后取 2 mm 厚的冠状脑片充分固定后常规脱水透明石蜡包埋用石蜡切片机制作厚5 μm 冠状切片每个标本取 3 张片行 Edu 及Nestin **荧光染色8

1 6 Edu 及 Nestin **荧光染色    采用 Edu 组织切片试剂盒进行 Apollo 染色严格按照说明书进行操作然后滴加 100 μL 1 × DAPI 染色反应液避光室温孵育 30 min 后弃染色反应液无菌磷酸盐缓冲液( phosphate buffered salinePBS ) 清洗 3 次洗脱 DAPI 反应液检测 Edu 阳性细胞采用柠檬酸盐抗原修复液进行抗原修复后PBS 清洗 1  3次山羊血清 37  ℃ 封闭 30  60  min抗 Nestin 抗体 1∶50 稀释成工作浓度后孵育一抗37 ℃ 作用30  min0 01  mol · L  1 磷酸盐吐温缓冲液(  phos- phate  buffered  saline  with  tween-20PBST) 缓冲液震荡漂洗 3 次每次 5 min  1∶1 000 羊抗鼠荧光二抗37  ℃ 湿盒避光作用 30 min0 01 mol·L  1 PBST避光漂洗 3 次每次 5  min甘油缓冲液封片在显微镜上同一视野内分别用 488 nm  555 nm 波长进行激发检测荧光显微镜下观察各组海马区齿状回 阳性细胞数每只大鼠随机选取海马齿状回区各 3 张切片每张切片每高倍镜下计数 5 个视野并拍照 取其均值作为阳性细胞数9

1. 7 统计学处理 应用 SPSS 19 0 对数据进行处理计量资料以均数 ± 标准差( x珋± s) 表示采用析因的方差分析进行检验组间比较用 LSD 检验方法 检验水准 α = 0 05

2 结果

1 3 组大鼠脑组织齿状回 Edu 阳性细胞比较结果见图和表 1单纯损伤组和VPA **组大鼠海马齿状回内Edu 阳性细胞数于造模后第3 天开始增高于造模后第 21 天达高峰在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组大鼠 Edu 阳性细胞数均高于正常对照组( P  0 01) ; 而 VPA **组大鼠各时间 Edu 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P  0. 01) 。

2 2 3 组大鼠脑组织齿状回 Nestin 阳性细胞比较结果见图和表 1单纯损伤组和VPA **组大 鼠海马齿状回内 Nestin 阳性细胞数于造模后第 3 天开始增高于造模后第 21 天达高峰在同一时间点单纯损伤组和 VPA **组 Nestin 阳性细胞均高于正常对照组( P  0 01) ; 而 VPA **组大鼠各时间 Nestin 阳性细胞数较单纯损伤组明显增加( P  0. 01) 。




3 讨论

动物实验研究证明颅脑损伤后可诱导海马齿 状回等部位内源性 NSC 的分裂增殖且多数可分化为成熟颗粒神经元10-11但这种由创伤诱导的神经干****往往不能改善脑外伤所造成的损害VPA 作为组蛋白去乙酰化酶( histon deacetylaseHDAC) 抑制剂对**神经系统损伤后局部炎症反应有抑制作用 近年来有研究表明无论在体外还是在体内VPA 均具有保护细胞和抗细胞凋亡的作用[12]

Edu 是一种胸腺嘧啶核苷类似物能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶( T) 渗入正在复制的 DNA 分子中通过基于 Edu Apollo 荧光染料的特异性反应快速检测细胞 DNA 复制活性适用于细胞增殖细胞分化生长与发育DNA 修复病毒复制

胞标记示踪等方面的研究与传统的 5-溴脱氧尿嘧啶核苷相比其分子量小更容易穿过细胞膜 有效在组织间进行渗透从而实现快速处理组织和 器官的切片标本而且在检测时不需要对标本进行 变性处理不会出现因变性引起 DNA 结构改变因此有效保证了 DNA 结构的完整性13-15增加了检测的灵敏度和准确度Nestin 属于胚胎性第Ⅵ类中间丝蛋白主要定位于细胞基质内在**神经系统 发育中仅在胚胎期表达出生后即停止表达16-17; 未分化和具有分裂能力的神经前体细胞内有丰富的Nestin 阳性表达随着其向神经元和神经胶质细胞的进一步分化Nestin 的表达即逐渐降低而被星形胶质细胞标志物即胶质纤维酸性蛋白波形蛋白或 神经丝所替代而颅脑损伤可引起成体脑内 NSC 增殖表现为 Nestin 表达增高所以多将 Nestin 用于鉴定损伤后**神经系统内 NSC 的增殖变化16-17因此本实验以 Edu Nestin 作为观察指标来研究VPA 对大鼠颅脑损伤后海马齿状回 NSCs 增殖变化的影响

本实验应用 VPA 作用于颅脑损伤大鼠于不同时间点观察 Edu  Nestin 阳性细胞的表达情况实验结果显示应用该**后 Edu  Nestin 阳性细胞数与正常对照组及单纯损伤组比较明显增加; VPA **组大鼠 Edu  Nestin 阳性细胞数在应用VPA 3 d 后比单纯损伤组稍有增加之后增加渐趋明显至第 21  天达高峰28  d 与 21  d 比较不再增加从而说明 VPA 对颅脑损伤大鼠海马成体 NSC 有原位激活作用在颅脑损伤前 21 d 应用该药对NSC 的激活作用明显之后作用逐渐减弱这为临床用药时间窗的确定提供了参考依据另外从实验 中也可以看到颅脑损伤后不管是单纯损伤组还是VPA **组海马齿状回 Edu  Nestin 阳性细胞数均比正常对照组大鼠明显增加这说明颅脑损伤对 大鼠海马成体 NSC 也有原位激活作用而且 VPA 与颅脑损伤有协同作用共同促进大鼠海马成体NSC 原位激活的作用 VPA 促进 NSC 增殖的具体机制以及其动态迁移的过程尚不清楚还有待于 进一步的系统研究