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冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

·基础医学论著/ 研究·

冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

韦 斌1 王 强1 姜 浩2 朱志华1 陈广琴1 尹 玮1 骆 虹1

摘要: 目的        观察冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的病理变化进一步证实冠通方对心肌细胞的保护作用 48 只新西兰大白兔随机分为假手术组模型对照组中药对照组冠通方大剂量组冠通方中剂量组冠通方小剂量组每组各 8 只各组分别连续灌胃 14 d制备左室心肌病理切片比较各组病理切片在光镜下心肌细胞病理形态学结构变化使用原位末端标记法( TUNEL 法) 测定各组凋亡细胞指数结果 冠通方大中剂量组心肌细胞在光镜下的结构形态得到较好的保护冠通方大中剂量组细胞凋亡指数较模型组显著下降( P 005) 结论    冠通方可以减轻心肌缺血再灌注心肌细胞的损伤有效减少心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡从而达到保护心肌细胞的作用

关键词: 心肌缺血再灌注损伤; 冠通方; 机制研究

中图分类号: 5422    2855    文献标识码: A    doi: 103969 / jissn1672-1349201713008    文章编号: 1672-1349( 2017) 13-1569-04

心肌缺血再灌注损伤( myocardial ischemia reperfu- sion injuryMII) 是心脏缺血性病变再通后常见的并发症可导致心肌细胞超微结构功能代谢及电生理  等方面发生进一步损伤并可出现严重的心肌细胞内 凋亡基因的表达增高或心肌细胞凋亡冠通方的近期 药理研究表明1]:  使用冠通方预处理可使缺血再灌注损伤( IRI) 大鼠模型的损伤心肌组织中白细胞介素-8 ( IL-8) 表达下降白细胞介素-10( IL-10) 表达增高有效抑制炎症机制及坏死机制起保护心肌的作用 研究通过后期动物实验观察不同剂量的冠通方干预兔  心脏再灌注损伤后心肌细胞的凋亡及病理形态改变 进一步验证了冠通方对心肌细胞的保护作用

1 材料与方法

1.1 动物 48 只新西兰大白兔购自广西医科大学实验动物中心生产许可证号 SCXK( 桂) 2011-0003体质量 25 kg  3 kg适应性饲养 1 周后开始分组

1.2 实验** 冠通方组成: 田七 45  g生晒参 100 g丹参 150 g地龙 150 g全瓜蒌 150 g绞股蓝 150 g麦冬 150  g陈皮 100  g由广西中医药大学制药厂按上述配方制成颗粒剂( 每包含生药 4 g) 分装规格为每包 35 g复方丹参滴丸( 每粒 27  mg) 由天津天士力制药股份有限公司生产( 国药准字 Z10950111生产批号 101210) 

1.3 实验试剂及仪器 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒为德国 oche 公司生产20 ℃ 保存使用前置于 4 ℃溶解混合; DAB 显色液试剂盒为北京中杉金桥生物有限公司生产4 ℃ 保存使用前置于室温与稀释液以 1

∶ 25 稀释混合现配现用; 蛋白酶 K 溶液为北京中杉金桥生物有限公司生产20 ℃ 保存使用前置于 4 ℃ 1 ∶ 25 稀释现配现用; 磷酸盐缓冲液( PBS) 为北京中杉金桥生物有限公司生产粉剂 4 ℃ 保存使用前置于37 ℃ 与蒸馏水0  01 mol / L 稀释pH 为7  74现配现用; 其余甲醛酒精二甲苯等均为国药集团化学试剂有限公司生产室温避光密封保存全自动脱水机( 德国 LeicaASP300S) 石蜡切片机( 德国 LeicaM2245) 奥林巴斯显微镜( 日本  OLYMPUS BX53) 病理图文摄像头( 日本OLYMPUSDP73) 小动物呼吸机( 北京智鼠多宝生物科技有限公司DW-3000) 

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将 48 只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为 6 组分别为假手术组模型对照组中药对照组复方丹参滴丸 54 mg / ( kg·d) 冠通方大剂量组36 g / ( kg·d) 冠通方中剂量组18 g / ( kg·

d) 冠通方小剂量组09 g / ( kg·d) 每组 8 只用药剂量根据人兔临床用药剂量换算公式2]换算成兔用药量实验动物行分笼饲养于每天早上灌胃给药假手术组和模型对照组予蒸馏水灌胃各组均连续灌胃14 d于末次给药 1 h 后进行标本采集

1.4.2 2 模型建立 经耳缘静脉注射戊ba比妥钠 30 mg / kg 麻醉后背位固定四肢皮下连接心电图电极记录标  Ⅱ导联心电图颈部正中切开皮肤钝性分离颈前肌 切开气管插入 Y 型气管插管连接微型人工 呼吸机( 潮气量1 0 mL / kg  1 5 mL / kg 频 率4 0次/ min) 沿胸骨左缘 3  4 肋间隙开胸暴露心脏采用 5  0 线结扎冠状动脉左前降支(  LAD)  法制备心肌缺血再灌注模型为避免实验动物心肌梗死面积过大导致死亡 冠状动脉阻断点应在冠状动脉左前降支向下 5 mm  10 mm 处选择结扎位点以心电图出现 ST段弓背抬高和结扎线以下心肌组织颜色变暗局部节段性运动 良为结扎成待结扎 40 min 后剪断手术线实现再灌注灌注时间为 2 h以缺血区转红并反应性充血收缩活动逐渐恢复ST 段恢复 1 /2 以上为再灌注成功假手术组只穿线不结扎余操作同上

1.4.3 标本采集及指标检测

IRI 心肌组织 HE 染色病理切片 造模实验结束后处死兔子剪下心脏造模实验结束后处死兔子剪下心脏取左心室心肌( 包括缺血边缘区心肌缺血区冠状动脉结扎区心肌组织) 。将标本置于 10% 中性甲醛液中固定经全自动脱水机脱水 14 h常规石蜡包埋石蜡切片厚 4 μm常规脱蜡至水进行 HE 染色封片镜下观察心肌组织基本病理改变

1.4.3.1 TUNEL 法染色 参考罗氏 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒说明书进行用 03%过氧化氢溶液封闭 30 min; 20 mg / L 蛋白酶 K 消化膜蛋白及核蛋白; 加入TUNEL 反应液37  ℃ 孵育 60  min; 加入 FITC 标记抗体DAB 显色苏木素复染脱水透明封片

1.4.3.2 心肌细胞凋亡指数测量   在光镜下观察心肌细胞凋亡情况电镜下呈棕色颗粒者为染色阳性的凋亡心肌细胞心肌细胞凋亡指数观察:  每只兔子观察4 张切片每张切片在高倍镜下( 400 ×) 随机观察 5 个不同视野每个视野计算凋亡细胞个数和所有细胞个数以凋亡阳性细胞数/ 总细胞数的百分比为心肌细胞凋亡指数取平均值

1.5 统计学处理    本研究采用 SPSS Statistics 190 进行实验数据统计用单因素方差分析计量资料以均 标准差( x ± s ) 表示组间比较用q 检验P 

005 为差异有统计学意义

各组心肌组织HE 染色病理形态比较 假手术组心肌细胞形态结构完整细胞排列整齐无明显病理损伤MIRI 模型组心肌细胞质增多细胞肿胀明显细胞排列紊乱横纹不清并呈现点片状坏死灶提示细胞坏死程度严重冠通方小剂量组可见心肌细胞水肿排列紊乱细胞浆增多有明显的病理损伤对照组和冠通方大中剂量组心肌细胞肿胀较轻心肌细胞偶有坏死细胞排列有序详见图 1

 


各组心肌细胞凋亡情况比较 光镜下呈棕色的心肌细胞核为凋亡的阳性细胞呈蓝色则为非凋亡的阴性细胞本研究结果表明: 冠通方大中剂量组凋亡细胞数较模型组显著减少详见图 2各组心肌细胞凋亡指数比较见表 1

 


 


     3 讨 论

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式其参与缺血再 灌注损伤的病理过程是缺血再灌注损伤引起心肌细 胞死亡的主要原因成为缺血再灌注损伤影响组织心 脏功能的重要途径和表现形式已有许多研究表明 MIRI 与细胞凋亡密切相关3-5]因此减少心肌细胞凋亡是减少缺血再灌注心肌损伤的有效途径

MIRI 中医病机包括气虚血瘀痰饮不同的病理过程谢连娣等6]指出气虚导致血瘀和痰饮的形成 血瘀和痰饮导致气虚程度进一步加重急性心肌梗死 时血液供应骤然停止失去了血液的濡养和运载; 急性心肌梗死时血栓堵塞血液的正常运行邪正交争 气损伤; 再灌注时突然过多的血液等待运送到组织远端增加心脏的负担均导致气虚的形成心气虚无力 推动血液运行造成微血管栓塞形成“血瘀”气虚血瘀可以导致水液代谢受到影响水液留聚形成“ 饮”多数学者亦认为缺血再灌注损伤的过程涉及气虚血瘀痰饮痰瘀化热化毒; 以气虚为本血瘀痰饮为标

冠通方方中田七善于**化瘀消肿止痛其化瘀 血而不伤新血; 丹参性寒凉血又善**化瘀清瘀热 消痈肿除烦**;  地龙咸寒善于**祛瘀通络同时又能清热化痰;  瓜蒌甘寒微苦善于清热化痰**宽胸消肿散结同时又具有润肠通便泻腑安脏之功;   晒参善于大补元气同时又有生津之功; 绞股蓝甘苦性寒具有**养阴消热**清热祛痰之功;  麦冬甘苦微寒清热养阴生津;  陈皮辛散温通善于**燥湿化 诸药合用则具有**养阴清热**化痰**活  血化瘀通络之功7]田七又名三七主产于云南广西 等地现代基础研究表明:    三七中含有三七总皂苷( PNS) 三七的主要成分是三七总皂苷已经有报道关于 PNS 有良好的抗氧化作用8并能抵抗自由基对心肌缺血再灌注后导致的心肌细胞损伤此外三七皂  苷可抑制脂质过氧化反应减轻心肌细胞的受损情况 增强抗氧化效果并具有抑制血小板聚集促进纤维蛋  白溶酶的活性降低血液黏度促进血栓溶解改善血  液流动的作用顾国嵘等9]通过酶学形态学**组织化学等研究表明PNS 缺血预处理 24 h 后能明显减少缺血-再灌注导致的心肌细胞坏死和凋亡对缺血- 再灌注心肌起到延迟保护作用证明三七**缺血性 心脏病的基础PNS 能扩张冠脉增加心肌营养血流量改善心肌微循环明显降低心肌耗氧量同时 PNS 的抗脂质过氧化作用也是其保护缺血-再灌注心肌的  重要方面丹参的抗氧化成分有丹参酮类丹参素  酚酸类化合物原儿茶醛咖啡酸及迷迭香酸有研究指出10-11丹参酮 Ⅱ A  可抑制细胞膜上的  NADH /NADPH 氧化酶的激活提高超氧化物歧化酶( SOD) 的活性**氧自由基并抑制脂质过氧化反应发挥保护血管内皮细胞的作用研究表明12] 丹参冻干粉对经皮冠状动脉介入**( PCI) MIRI 有保护作用其可能的机制是抑制炎症反应改善内皮功能

本研究通过冠通方对兔 MIRI 心肌细胞凋亡研究时发现冠通方可有效发挥心肌细胞保护作用使 MI- RI 细胞凋亡趋势下降减少心肌病理损伤为心肌细胞后期修复打好了坚实的基础冠通方对 MIRI 损伤心肌的保护作用是多机制多靶点综合作用因此冠通方对心肌细胞的保护机制依然需要后续探索研究